1-Deoxynojirimycin(DNJ)이 OPA1 타겟팅을 통해 미토콘드리아 cristae를 회복시키고 심장 기능을 개선하는 혁신적 메커니즘. iPSC-CM 모델과 동물 실험으로 검증된 미토콘드리아 구조 치료 전략을 소개합니다.

1. 비대심근병증과 미토콘드리아: 왜 새로운 치료법이 필요한가

비대심근병증(Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM)은 젊은 사람들의 급사 원인 중 가장 흔한 질환입니다. 전형적으로 좌심실의 비대칭적 중격 비대로 나타나며, 대부분 상염색체 우성 유전 형태로 근육 단백질 유전자 돌연변이에 의해 발생합니다.

미토콘드리아 비대심근병증이란?

일부 가족성 HCM은 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 돌연변이에 의해 발생하며, 모계 유전 양상을 보입니다. 이를 미토콘드리아 비대심근병증이라 합니다.

특징:
– 일반 HCM과 유사한 임상 증상
– 복잡하고 독특한 병리생리학
– mtDNA 돌연변이로 인한 미토콘드리아 결함
– ATP 합성 효율 저하
– 칼슘 항상성 불균형

기존 치료의 한계

현행 HCM 치료:
– β-차단제: 교감신경 억제, 심박수 감소
– Diltiazem, Verapamil: L-type 칼슘 채널 차단

이러한 약물들은 근육 단백질 유전자 돌연변이에 의한 HCM에는 효과적이지만, 미토콘드리아 HCM에 대한 효능은 제한적이고 연구도 부족합니다.

2. DNJ 발견: Cybrid-iPSC-CM 2단계 스크리닝

이 연구팀은 이전에 MT-RNR2 돌연변이가 HCM과 연관되어 있음을 보고했습니다. 이번 연구에서는 이 돌연변이를 가진 환자에게 효과적인 약물을 찾기 위해 독창적인 2단계 약물 스크리닝 전략을 사용했습니다.

1단계: Cybrid를 이용한 1차 스크리닝

Cybrid(Cytoplasmic Hybrid Cell):
– 환자의 미토콘드리아 + 표준 핵 배경
– 배양이 쉬워 대규모 스크리닝에 이상적
– 특정 mtDNA 돌연변이의 병리적 효과 재현

스크리닝 과정:
1. TargetMol 미토콘드리아 타겟 화합물 라이브러리(L5300)에서 41개 화합물 선택
2. 미토콘드리아 막전위(MMP) 측정으로 효능 평가
3. 1차적으로 8개 화합물 발견
4. 3개 세포 클론에서 재검증 → 3개 후보 확정

최종 3개 후보:
1. 1-Deoxynojirimycin (DNJ)
2. Astragalus polyphenols
3. Verbenalin

2단계: iPSC-CM을 이용한 생리학적 검증

iPSC-CM (유도만능줄기세포 유래 심근세포):
– 환자의 체세포에서 재프로그래밍
– 통합된 게놈 정보 보유
– 전기생리학적 반응, 칼슘 처리 등 복잡한 심장 표현형 재현
– 전임상 시험에 이상적

검증 기준:
– 갈락토오스 배지에서 생존율 (미토콘드리아 의존 환경)
– 전기생리학적 특성
– 칼슘 항상성
– 세포 크기 (비대 정도)

결과: DNJ가 가장 우수한 효능을 보임

DNJ란?

1-Deoxynojirimycin:
– 천연 alkaloid 화합물
– 뽕나무 잎에서 추출
– 이미 α-glucosidase 억제제로 알려짐
– 이번 연구에서 미토콘드리아 보호 효과 새롭게 발견

3. DNJ의 심장 보호 효과: iPSC-CM 검증

HCM iPSC-CM은 환자의 병리적 표현형을 정확하게 재현합니다.

전기생리학적 이상 개선

HCM iPSC-CM의 문제:
– 부정맥: 불규칙한 리듬
– 활동전위 지속시간(APD) 연장: APD50, APD70, APD90 모두 증가

DNJ 치료 후:
– 부정맥 발생률 유의하게 감소
– APD50, APD70, APD90 정상화
– 규칙적인 전기적 리듬 회복

칼슘 항상성 회복

HCM iPSC-CM의 칼슘 문제:
– 비정상적인 Ca²⁺ 처리 이벤트
– 이완기 Ca²⁺ 농도 증가
– Ca²⁺ decay time 연장

DNJ 치료 후:
– Ca²⁺ 신호 정상화
– 이완기 Ca²⁺ 유의하게 감소
– Decay time 정상 범위로 회복

심근세포 비대 감소

비대 지표:
1. 세포 크기: α-actinin 염색으로 측정
2. ANP (Atrial Natriuretic Peptide): 심장 스트레스 마커
3. NFATC4 핵 전위: 비대 신호 전달 경로

DNJ 치료 효과:
– 세포 크기 유의하게 감소 (HCM: 평균 증가, DNJ: 정상 수준)
– ANP 발현 감소
– NFATC4 핵 내 전위 억제 (비대 신호 차단)

미토콘드리아 기능 개선

측정 지표:
– MMP (미토콘드리아 막전위): 증가
– ATP 생산: 회복
– 미토콘드리아 칼슘: 정상화

DNJ 농도-반응 곡선:
– EC50: 약 10-20 μM
– 독성 없이 효과적

4. OPA1: DNJ의 분자 표적

DNJ의 작용 메커니즘을 규명하기 위해 pulldown + 질량분석 전략을 사용했습니다.

OPA1이란?

Optic Atrophy 1 (OPA1):
– 핵 유전자 암호화 dynamin 관련 대형 GTPase
– 미토콘드리아 cristae 생성 및 리모델링의 주요 조절자
– Oligomer 형성으로 기능 발휘

OPA1의 역할:
1. Cristae junction (CJ) 수와 안정성 유지
2. 호흡 복합체 supercomplex (RCS) 안정성 촉진
3. 호흡 효율 향상

OPA1 결핍 시:
– Cristae 구조 붕괴
– 미토콘드리아 기능 장애

OPA1 과발현 시 (마우스 연구):
– 미토콘드리아 활성 개선

DNJ-OPA1 상호작용 증명

실험적 증거:

1. Pulldown 실험:
2. 정제된 Flag-His-OPA1 단백질에 DNJ가 결합
3. Immunoblot으로 확인
4. 내재성 단백질 확인:
5. 세포 용해물에서 DNJ가 내재성 OPA1에 결합
6. OPA1 항체로 검증
7. MST (Microscale Thermophoresis) 분석:
8. DNJ와 정제 EGFP-OPA1의 결합 친화도 측정
9. Kd (해리 상수) 확인

DNJ가 OPA1 Oligomerization 촉진

핵심 발견:

실험 방법:
– EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)로 교차결합
– SDS-PAGE 및 Western blot으로 oligomer 검출

결과:
– HCM cybrid: OPA1 oligomer 감소
– DNJ 처리 후: OPA1 oligomer 유의하게 증가
– 시간 의존적 증가 (1, 2, 4, 6, 8시간)
– In vitro 분리 미토콘드리아에서도 동일 효과

OPA1의 heteropolymer 기능 회복

OPA1은 homopolymer뿐만 아니라 heteropolymer도 형성합니다:

1. OPA1-IMMT (MICOS 복합체):
2. CJ 수와 안정성 조절
3. OPA1-ATP5B (F1Fo-ATP synthase):
4. 호흡 사슬 억제 역전

Co-immunoprecipitation 결과:
– HCM cybrid: OPA1-IMMT 및 OPA1-ATP5B 상호작용 감소
– DNJ 처리 후: 두 상호작용 모두 강력하게 회복

5. 미토콘드리아 Cristae 구조 회복

미토콘드리아 cristae는 내막의 주름 구조로, 산화적 인산화(OXPHOS) 효율의 핵심입니다.

HCM Cybrid의 미토콘드리아 결함

형광 현미경 (TOM20 염색):
– 미토콘드리아 단편화 (fragmentation)
– 정상적인 관 모양(tubular) 구조 상실

전자 현미경 (TEM):
– Cristae 구조 결함:
– 불규칙한 cristae
– 빈 공간 증가
– CJ 감소

DNJ 처리 후 구조적 개선

정량 분석 지표:

1. 전체 Cristae 형태:
2. 정상 cristae 비율 증가
3. 이상 cristae 비율 감소
4. Cristae 수:
5. HCM: 평균 ~5개/미토콘드리아
6. DNJ 처리 후: ~8개/미토콘드리아 (p < 0.001)
7. Cristae 폭:
8. HCM: 좁고 불규칙
9. DNJ 처리 후: 유의하게 증가 (p < 0.001)
10. CJ 빈도 (CJ 수 / Cristae 수):
11. HCM: 감소
12. DNJ 처리 후: 정상 수준으로 회복 (p < 0.01)

iPSC-CM에서도 동일 효과

HCM iPSC-CM:
– 이상 및 빈 미토콘드리아 증가
– DNJ: 현저한 회복

정량 분석:
– Cristae 수, cristae 폭, CJ 빈도 모두 유의한 개선
– 면역형광으로는 명확한 차이 없음 (고해상도 TEM 필요)

6. 호흡 복합체와 ATP 생산 개선

잘 형성된 cristae는 호흡 복합체 supercomplex (RCS) 안정성과 활성에 필수적입니다.

mtDNA 인코딩 ETC 복합체 발현

MT-RNR2 돌연변이(미토콘드리아 ribosomal RNA):
– mtDNA 인코딩 ETC 복합체 서브유닛 발현 감소
– 번역 결함
– RCS 조립 및 안정성 부분 저해

DNJ 효과:
– RCS 안정성 효과적으로 회복
– Cristae 개선으로 RCS 조립을 위한 조직화된 미세 영역 제공

호흡 복합체 활성 회복

측정 복합체:
– Complex I
– Complex III
– Complex IV
– Complex V (ATP synthase)

HCM cybrid:
– 모든 복합체 활성 상당히 감소

DNJ 처리 후:
– 모든 복합체 활성 현저하게 회복
– Cristae 및 RCS 안정성 개선 덕분

산소 소비율(OCR) 개선

Seahorse 분석:

Basal OCR:
– DNJ: 대조군 대비 증가

ATP-linked OCR:
– DNJ: 유의하게 증가

Maximal OCR:
– DNJ: 증가

Spare capacity & Proton leak:
– 유의한 변화 없음

ATP 생산 회복

HCM iPSC-CM:
– 총 ATP 생산 감소
– 미토콘드리아 ATP 생산 감소

DNJ 처리 후:
– 총 ATP 정상 수준
– 미토콘드리아 ATP 회복
– 미토콘드리아가 세포 ATP의 주요 공급원임을 확인

mtDNA 복제 수 정상화

HCM iPSC-CM:
– mtDNA copy number 비정상적으로 증가 (보상 메커니즘)

DNJ 처리 후:
– mtDNA copy number 정상화

7. 동물 모델 검증: 심장 비대 개선

In vivo 효능을 검증하기 위해 Angiotensin II (Ang II) 유도 심장 비대 마우스 모델을 사용했습니다.

실험 설계

Ang II 모델:
– Ang II 만성 투여 → 심장 비대 유도
– HCM과 유사한 병리학적 특징

그룹:
1. 대조군 (Saline)
2. Ang II
3. Ang II + DNJ

심장 비대 감소

측정 지표:

1. 심장 무게 / 체중 비율 (HW/BW):
2. Ang II: 유의하게 증가
3. DNJ: 감소 (비대 완화)
4. 심장 무게 / 경골 길이 비율 (HW/TL):
5. 동일한 경향
6. 조직학적 평가 (H&E 염색):
7. Ang II: 심근세포 크기 증가
8. DNJ: 심근세포 크기 감소
9. 비대 마커:
10. ANP, BNP mRNA 및 단백질 발현
11. Ang II: 증가
12. DNJ: 감소

미토콘드리아 기능 개선

심장 조직 미토콘드리아:

1. OPA1 oligomer:
2. Ang II: 감소
3. DNJ: 증가
4. Cristae 구조 (TEM):
5. Ang II: cristae 결함
6. DNJ: cristae 수, 폭, CJ 빈도 개선
7. RCS 안정성:
8. DNJ: 회복
9. 호흡 복합체 활성:
10. Complex I, III, IV, V 모두 개선
11. ATP 생산:
12. DNJ: 증가

심장 기능 개선

심초음파 평가 (가능한 경우):
– 박출률(EF)
– 단축률(FS)
– 좌심실 벽 두께

(논문에 구체적 데이터 제공되지 않았으나 예상 개선)

8. 임상적 의의와 전망

연구의 핵심 성과

1. 혁신적 약물 스크리닝 플랫폼:
– Cybrid + iPSC-CM 조합
– 미토콘드리아 질환 약물 발견에 적용 가능
– 환자 맞춤형 스크리닝 가능

2. DNJ의 새로운 메커니즘 발견:
– 기존: α-glucosidase 억제제 (당뇨병 치료)
– 신규: OPA1 타겟팅 미토콘드리아 보호제
– Drug repositioning의 성공 사례

3. OPA1 oligomerization의 치료적 중요성:
– OPA1 조절이 미토콘드리아 질환 치료의 핵심 표적
– 향후 OPA1 특이적 약물 개발 근거 제공

4. Cristae 구조-기능 관계 규명:
– Cristae 회복 → RCS 안정성 → OXPHOS 효율 → ATP 생산
– 미토콘드리아 질환 병리기전 이해 증진

임상 적용 가능성

미토콘드리아 HCM:
– MT-RNR2 돌연변이 환자에게 직접 적용 가능
– 다른 mtDNA 돌연변이 HCM에도 효과 기대

다른 미토콘드리아 질환:
– 미토콘드리아 근병증
– 리 증후군 (Leigh syndrome)
– MELAS, MERRF 등

심혈관 질환:
– 심부전
– 허혈성 심질환
– 심근경색 후 회복

노화 관련 질환:
– 미토콘드리아 기능 저하가 핵심인 노화
– 신경퇴행성 질환

향후 연구 방향

1. 임상시험:
– Phase I: 안전성 평가
– Phase II: HCM 환자 효능 평가
– 최적 용량 및 투여 방법 확립

2. 다른 OPA1 조절제 개발:
– DNJ 유도체 합성
– 더 강력하고 특이적인 화합물

3. 병용 치료:
– 기존 HCM 치료제(β-차단제 등)와 병용
– 시너지 효과 평가

4. 바이오마커 개발:
– OPA1 oligomer 수준 측정
– Cristae 형태 평가 기술
– 치료 반응 모니터링

5. 유전자 치료와의 병용:
– mtDNA 편집 기술과 결합
– 구조적 + 유전적 치료

DNJ의 장점

기존 약물:
– 이미 α-glucosidase 억제제로 일부 국가 승인
– 안전성 데이터 축적
– Miglitol (상품명)과 유사

천연 화합물:
– 뽕나무 잎에서 추출
– 비교적 안전
– 장기 사용 가능성

다중 효과:
– 당뇨병 + 미토콘드리아 보호
– 일석이조

제한점:
– 혈액-뇌 장벽 통과 제한적 (중추신경계 질환)
– 생체이용률 최적화 필요
– 장기 안전성 추가 평가 필요

세포 치료와의 통합

iPSC-CM 이식:
– DNJ 전처리 iPSC-CM
– 미토콘드리아 기능 강화된 세포
– 이식 성공률 향상

조직 공학:
– 3D 심장 조직 제작 시 DNJ 사용
– 더 건강한 engineered 심장 조직

마무리하며

이 연구는 1-Deoxynojirimycin(DNJ)이 OPA1 타겟팅을 통해 미토콘드리아 cristae 구조를 회복시키고, 호흡 복합체 안정성과 ATP 생산을 개선하여 미토콘드리아 비대심근병증을 치료할 수 있음을 입증했습니다.

핵심 메커니즘:

DNJ 투여 ↓ OPA1 결합 및 oligomerization 촉진 ↓ OPA1-IMMT/ATP5B 상호작용 강화 ↓ Cristae junction 안정화 + Cristae 수/폭 증가 ↓ RCS 안정성 및 활성 향상 ↓ OXPHOS 효율 증가 → ATP 생산 회복 ↓ 심근세포 기능 정상화 (전기생리, 칼슘 항상성, 세포 크기) ↓ 심장 비대 감소 및 기능 개선 

혁신적 기여:

1. Cybrid + iPSC-CM 2단계 스크리닝 플랫폼 확립
2. DNJ의 새로운 미토콘드리아 보호 메커니즘 발견
3. OPA1 oligomerization의 치료적 중요성 입증
4. Cristae 구조 회복이 미토콘드리아 질환 치료의 핵심임을 확인
5. In vitro (cybrid, iPSC-CM) + in vivo (마우스) 종합 검증

DNJ는 미토콘드리아 비대심근병증뿐만 아니라 다양한 미토콘드리아 질환의 치료제로서 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 향후 임상시험을 통해 환자들에게 실질적인 도움을 줄 수 있기를 기대합니다.

참고문헌

1. Zhuang, Q., et al. (2023). “1-Deoxynojirimycin promotes cardiac function and rescues mitochondrial cristae in mitochondrial hypertrophic cardiomyopathy.” Journal of Clinical Investigation, 133(14), e164660. https://doi.org/10.1172/JCI164660
2. Maron, B. J., & Maron, M. S. (2022). “Hypertrophic cardiomyopathy.” Lancet.
3. Cogliati, S., et al. (2016). “Mitochondrial cristae: where beauty meets functionality.” Trends in Biochemical Sciences.
4. Varanita, T., et al. (2015). “The OPA1-dependent mitochondrial cristae remodeling pathway controls atrophic, apoptotic, and ischemic tissue damage.” Cell Metabolism.